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　　工學院陳匡時課題組在活細胞單分子成像DNA技術領域取得突破性進展

　　最近，工學院生物醫(yī)學工程系陳匡時課題組基于分子信標(MB)與CRISPR/dCas9 系統(tǒng)成功研制出一種名為CRISPR/dual-FRET MB的新型活細胞基因成像技術。該研究成果已發(fā)表于Nucleic Acids Research(《核酸研究》)(IF = 11.147)，題目為 “CRISPR/dual-FRET molecular beacon for sensitive live-cell imaging of non-repetitive genomic loci”。

　　目前，在活細胞中成像基因組主要借助熒光蛋白實現(xiàn)。但是熒光蛋白具有亮度低、光穩(wěn)定性低等缺點，需要給標記單一基因組位點標記多個熒光蛋白才可實現(xiàn)成像。然而，過度的熒光標記可能會對基因組位點的運動造成影響，因此，目前熒光蛋白方法在成像單基因組位點上的能力有限。許多研究已經(jīng)表明，有機染料具有比熒光蛋白更高的信號強度與光穩(wěn)定性，因此，基于有機染料的標記方法有望提高對單基因組位點的成像能力。

　　陳匡時課題組在先前的研究中已經(jīng)證實有機染料在活細胞中標記基因組位點的可行性。 所采取的手段是將CRISPR sgRNA進行改造，使其能夠與一種名為分子信標(MB)的寡核苷酸探針互補(CRISPR/MB: Wu X. et al, Nucleic Acids Res. 2018; 46, e80)。由于sgRNA具有高度可改造性，陳匡時課題組最新的工作進一步改造了sgRNA，使其能夠與一對可發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET) 的MB互補, 構建出CRISPR/dual-FRET MB (圖1)。由于只有當兩個MB 同時互補于同一個sgRNA時FRET信號才能產(chǎn)生，該方法能夠更好地區(qū)分來自基因組位點的信號與游離MB所造成的背景。實驗證明，CRISPR/dual-FRET MB通過三個sgRNA即可在普通寬場顯微鏡下成像單基因組位點(圖2A)，并且能區(qū)分不同基因組位點(MUC4, MUC1, IGR)的運動(圖2B)。值得一提的是，CRISPR/dual-FRET MB 是首個被報道的、僅需3個sgRNA 就能在寬場顯微鏡下成像單基因組位點(非重復序列)的技術。此外， CRISPR/dual-FRET MB的分子量比現(xiàn)有最靈敏的CRISPR 標記技術(基于熒光蛋白)小6倍以上，因此可能對被標記位點的生物學功能造成較小的影響。CRISPR/dual-FRET MB的應用有望幫助研究者對染色質高級結構的時空動態(tài)變化進行更深入細致的闡述。

　　該工作的第一作者是毛詩琦。應亞宸、吳小天和Christopher Krueger(PKU/GT/Emory聯(lián)合培養(yǎng)項目博士生)為工作的順利完成做出重要貢獻。通訊作者為陳匡時特聘研究員。此項工作得到了國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學基金的支持。

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