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　　工學(xué)院陳匡時(shí)課題組在基于CRISPR的單分子成像DNA技術(shù)領(lǐng)域取得新進(jìn)展

　　最近，工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系陳匡時(shí)">陳匡時(shí)課題組基于CRISPR基因編輯技術(shù)與分子信標(biāo) (MB) 研制出一種名為CRISPR/MB的新型單基因位點(diǎn)成像技術(shù)。該研究成果已發(fā)表于Nucleic Acids Research (《核酸研究》) (IF = 10.162)，題目為“A CRISPR/Molecular Beacon Hybrid System for Live-Cell Genomic Imaging”。

　　CRISPR基因編輯技術(shù)是一種能夠有效且穩(wěn)定地將目的基因敲除的方法。該技術(shù)是由Cas9 蛋白與single-guide RNA (sgRNA) 組成。Cas9 是一種DNA 內(nèi)切酶，sgRNA則同時(shí)具有能和特定基因組序列互補(bǔ)的位點(diǎn)(spacer 序列) 以及和Cas9 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。因此，Cas9在與sgRNA 形成復(fù)合體后能通過(guò)spacer 序列靶向特定基因位點(diǎn)并將其破壞，從而達(dá)到定點(diǎn)編輯基因組的目的。前人的研究發(fā)現(xiàn)，失去酶切活性的Cas9 (nuclease-deactivated Cas9, dCas9) 也能夠通過(guò)結(jié)合sgRNA 靶向特定基因組，由此開(kāi)創(chuàng)了使用dCas9與sgRNA 成像特定基因組的研究領(lǐng)域。

　　目前，基于CRISPR技術(shù)在活細(xì)胞中標(biāo)記基因組的方法主要通過(guò)將熒光蛋白連接于dCas9 或sgRNA上實(shí)現(xiàn)成像。但是熒光蛋白具有亮度低、易被光漂白以及不能被淬滅等缺點(diǎn)，在單分子成像單基因位點(diǎn)上能力有限。本研究所使用的分子信標(biāo) (MB)則是一種基于化學(xué)熒光基團(tuán)、具有可淬滅特性的寡核苷酸探針 (圖一)，其兩端分別連有一個(gè)化學(xué)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，在不與目的RNA結(jié)合時(shí)MB通過(guò)自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出低熒光狀態(tài)，而在與目的RNA互補(bǔ)后莖結(jié)構(gòu)解離進(jìn)入高熒光狀態(tài)，MB因其獨(dú)特的成像優(yōu)勢(shì)成為目前活細(xì)胞標(biāo)記內(nèi)源RNA的主要手段之一。通過(guò)改造sgRNA 的結(jié)構(gòu)，陳匡時(shí)">陳匡時(shí)實(shí)驗(yàn)室巧妙地將MB與CRISPR技術(shù)結(jié)合起來(lái)，成功研制出帶有MB靶序列(MTS)的sgRNA (SL2-sgRNA-MTS)，并證實(shí) dCas9 和SL2-sgRNA-MTS 能形成穩(wěn)定的復(fù)合體，并與特定的單基因位點(diǎn)結(jié)合。MB進(jìn)入細(xì)胞后能與復(fù)合體中的MTS 互補(bǔ)，使得該基因位點(diǎn)被熒光標(biāo)記。熒光成像顯示，被標(biāo)記后的單基因位點(diǎn)在傳統(tǒng)熒光顯微鏡下呈現(xiàn)單一亮點(diǎn) (圖二)。CRISPR/MB的研發(fā)與應(yīng)用有望幫助研究者對(duì)目的基因組在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位，及其與疾病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行更深入的闡述。

　　該工作的第一作者是吳小天。毛詩(shī)琦、楊艷濤等學(xué)生為工作的順利完成做出重要貢獻(xiàn)。通訊作者為工學(xué)院陳匡時(shí)">陳匡時(shí)特聘研究員。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金的支持。

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